2. ESPECIFICIDAD
Y MECANISMO DE ACCIÓN. Especificidad de sustrato. Factores que
contribuyen a la actividad catalítica
3. CINÉTICA
DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN.
4. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Efecto del pH y de la Temperatura sobre la actividad enzimática. Inhibición de las enzimas: reversible
(competitiva acompetitiva y no competitiva) e
irreversible. Enzimas reguladoras. Cooperatividad.
1. Concepto y estructura
Son moléculas de naturaleza proteica
especializadas en la catálisis de las reacciones biológicas. Son
biocatalizadores.
Para que las reacciones
bioquímicas que se dan en los seres vivos se produzcan en el laboratorio se
precisan condiciones de alta temperatura u otras condiciones que aporten la
energía necesaria para dichas reacciones. Pero esa elevación de la temperatura
resultaría muy perjudicial para los seres vivos. Las enzimas salvan ese
obstáculo y actúan como catalizadores mucho más eficaces que los catalizadores
hechos por el hombre.
Todas las enzimas conocidas son
proteínas de gran difusibilidad en los medios
líquidos del organismo. La mayoría son solubles en agua.
Atendiendo a la composición se
distinguen 2 tipos de enzimas:
*Holoproteínas:
cuya molécula está constituida solamente por secuencias de aminoácidos. Poco
frecuentes. Ej.: la ribonucleasa y la lisozima.
*Heteroproteínas:
cuya molécula está formada por 2 componentes:
1) Uno de naturaleza proteica,
llamado apoenzima. Los aminoácidos que forman
la apoenzima pueden clasificarse en diversos grupos:
.No esenciales: no participan
directa ni indirectamente en el proceso catalítico, de forma que pueden ser
eliminados de la cadena polipeptídica sin que se pierda la actividad enzimática.
.Estructurales: que mantienen
la estructura terciaria de la proteína enzimática. No
intervienen directamente en la catálisis, pero sí indirectamente, pues
determinan la posición del centro activo de la molécula.
.De unión o fijación: que
sujetan la apoenzima al sustrato y orientan la
molécula de éste de tal manera que aproximan la parte que ha de ser atacada por
la enzima al sitio catalítico de ésta.
.Catalíticos: responsables
directos de la actividad enzimática, que forman el
sitio catalítico.
Los aminoácidos de fijación y
los catalíticos forman el centro activo de la apoenzima,
que ocupa una pequeña parte de la molécula de la apoenzima.
2) Otro no proteico
(grupo prostético), llamado cofactor. El cofactor puede ser un ión
metálico, o bien una molécula orgánica de bajo peso molecular llamada coenzima.
Actualmente se sabe que las coenzimas desarrollan su actividad enzimática cumpliendo alguna o algunas de las siguientes
funciones:
.Colaborar en el acoplamiento del
sustrato al centro activo de la apoenzima.
.Servir como sitio adicional de
fijación del sustrato.
.Participar directamente en el
mecanismo catalítico, actuando de forma análoga a los aminoácidos catalíticos
del centro activo de la apoenzima.
El conjunto (apoenzima
+ cofactor), catalíticamente activo, se denomina holoenzima. La apoenzima
separada del cofactor es catalíticamente inactiva.
Además de los glúcidos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, las
células vivas contienen también unas sustancias orgánicas que actúan en
cantidades mínimas y que denominamos vitaminas. La importancia de estas
sustancias se manifestó al comprobar que algunos organismos no las pueden
sintetizar y deben adquirirlas, por tanto, por vía exógena.
Las vitaminas -que, para su estudio, suelen clasificarse en dos grandes grupos:
liposolubles e hidrosolubles-, son componentes esenciales de las coenzimas.
En la siguiente tabla aparecen las principales vitaminas, las
coenzimas de las que forman parte y las reacciones metabólicas específicas
catalizadas por las enzimas correspondientes.
2. Especificidad y mecanismo
de acción
Una reacción química A===>B tiene lugar porque cierto número de moléculas A
se encuentran con la suficiente energía como para alcanzar un estado activado,
que denominamos estado de transición, en el que es muy probable que se
establezca o se rompa algún enlace químico y se forme entonces el producto P.
La velocidad de una reacción
será proporcional a la concentración de moléculas en ese estado de transición.
Por eso hay 2 métodos generales mediante los cuales se puede acelerar la
velocidad de una reacción química:
-Elevar la temperatura:
pues se incrementa el n1 de moléculas capaces de
alcanzar el estado de transición (en muchas reacciones químicas la velocidad se
duplica cada 10 1C de aumento de la T).
-Añadir un catalizador:
que se combina con los reaccionantes de forma
transitoria y produce un estado de transición con menor energía de activación.
(Nota: la energía libre de activación es la diferencia entre la energía libre
-G- de 1 mol de sustancia en el estado de transición
y la de 1 mol de sustancia en el estado inicial).
Energía
libre de activación (ΔGº) calculada
para
La
descomposición de peróxido de hidrógeno a 20 ºC.
La catalasa acelera la v de la reacción más de
108 veces.
Condicioneslog
ΔGº(Kcal/mol)
Sin catalizar18
Catalizada con Pt
coloidal13
Catalizada por catalasa7
Las enzimas aceleran la v de las
reacciones por el segundo sistema. Actúan como catalizadores al disminuir la
energía de activación de las sustancias reaccionantes.
En toda reacción enzimática intervienen dos elementos: por una parte, la enzima;
por otra, el sustrato (sustancia o sustancias que, mediante una reacción
catalizada por la enzima, se transformará en otro
producto o productos).
Cuando se forman los productos
de la reacción se regenera el catalizador libre.
a) Especificidad de sustrato
de las enzimas
Una de las propiedades más
notables de las enzimas es su especificidad de acción, por la que actúan sólo
sobre determinados sustratos y producen sólo un tipo de reacción (sin
reacciones colaterales).
Si en una reacción de
laboratorio el rendimiento fuese de un 90%, podríamos darnos por satisfechos.
Pero si esa reacción fuese el paso de una secuencia de 10 etapas, cada una de
las cuales tuviese un rendimiento del 90%,en el producto final sólo recuperaríamos 1/3 del producto inicial. De no
ser por la especificidad de las enzimas, las células quedarían rápidamente
inmersas en un conjunto de reacciones laterales y productos secundarios.
EmilFisher
descubrió que las enzimas que hidrolizaban glucósidos eran capaces de distinguir
entre formas estereoisómeras de éstos. En 1894
enunció el principio de que la molécula del sustrato se adapta al centro activo
de la enzima del mismo modo que lo harían una llave y una cerradura, es decir,
que tienen una relación complementaria. El centro activo es el lugar de
la enzima que se adapta exactamente a la estructura molecular del sustrato y
actúa sobre éste para dar lugar al producto. La estructura del centro activo
explicala especificidad de acción de
las enzimas.
No obstante, los datos actuales
sobre la estructura de las enzimas han llevado a modificar el modelo clásico de
la llave y su cerradura para explicar la especificidad de la reacción enzimática. Actualmente se considera que esa esfecificidad radica en la naturaleza de los aminoácidos
de fijación del centro activo. Realizada esa fijación o anclaje, la enzima
puede modificar su forma y amoldarse parcialmente sobre el sustrato, de forma
que el centro catalítico quede correctamente situado para actuar. Entonces no
existiría como en la llave y la cerradura una adaptación predeterminada, sino
una adaptación inducida por los aminoácidos de fijación.
Además el grado de especificidad
puede ser muy variado.
Así, la aspartato-amoniaco-liasa, también conocida por aspartasa,
tiene una especificidad de sustrato casi absoluta. Además presenta una estereoespecificidad estricta (es incapaz de desaminar el D-aspartato).
Otra enzima estereoespecífica
es la lactato deshidrogenasa (sólo trabaja con
L-lactato).
En cambio, la fosfatasa alcalina hidroliza muchos ésteres
diferentes del ácido fosfórico. Y la carboxipeptidasacataliza la hidrólisis del enlace peptídico
C-terminal, cualquiera que sea la longitud de la cadena o el resto aminoácido
C-terminal.
En general, la especificidad del
sustrato sobre el que actúan las enzimas se debe a dos rasgos estructurales del
sustrato:
1) Un enlace químico susceptible
de ser atacado por la enzima.
2) Otra característica
estructural necesaria para efectuar su unión al centro activo de la enzima.
Dicha estructura se denomina grupo determinante de la posición.
b) Factores que contribuyen a
la actividad catalítica de las enzimas
Hemos dicho que las enzimas
incrementan de forma considerable la velocidad de las reacciones que catalizan. Son 4 los factores que parecen contribuir al
gran incremento de velocidad producido por las enzimas:
*Proximidad y orientación del sustrato.
La enzima puede fijar la molécula de sustrato de modo que el enlace susceptible
se halle:
-próximo al grupo catalítico
-bien orientado respecto al
grupo catalítico.
Esa proximidad y orientación
adecuadas del sustrato respecto al grupo catalítico permiten que se alcance con
facilidad el estado de transición y se incremente de forma considerable (en el
caso más espectacular hasta 53.000 veces) la velocidad de reacción.
*Catálisis covalente. Algunas enzimas se combinan
con el sustrato para formar un intermediario covalente que reacciona con más
facilidad para formar los productos.
Este compuesto se forma y se
destruye rápidamente.
*Catálisis ácido-base. Al
proporcionar grupos funcionales capaces de actuar como dadores o aceptores de
protones, la enzima puede efectuar una catálisis general ácida o básica.
La catálisis ácido-base
específica es la debida al incremento o disminución del pH.
En la catálisis ácido-base
general el catalizador actúa como aceptor o dador de protones.
La catálisis ácido-base general
proporciona un medio para efectuar la catálisis a pH
neutro (en el que las concentraciones de H+
y de OH- son muy bajas) de reacciones químicas que de otro modo
necesitarían concentraciones muy elevadas de esos iones.
*Factor de tensión de la catálisis enzimática. La enzima puede inducir una tensión o
una distorsión en el enlace susceptible de la molécula de sustrato, que
determine que la ruptura del enlace sea más fácil.
3. Cinética de las reacciones
catalizadas por enzimas. Ecuación de Michaelis-Menten
En las reacciones enzimáticas se da un efecto ausente en las no enzimáticas: la saturación con el sustrato.
A partir de la saturación la
reacción es esencialmente de orden cero respecto al sustrato (es decir,
se mantiene con un v constante).
-d[A]
reacc. química de 1er. orden:A ===> P-------
= K[A]
dt
-d[A]
reacc. química de 21 orden:A + B ===> P------- =
K[A][B]
dt
reacc. química de 3er. orden: son raras.
Teoría de Michaelis
y Menten:
Luego: La constante de Michaelis-MentenKM es igual a la concentración de
sustrato en la que la velocidad inicial de la reacción es la mitad de la
velocidad máxima.
Conviene recordar que la KM
no es un valor fijo para cada enzima, sino que puede variar con:
-la estructura del sustrato
-el pH
-la temperatura
*Transformaciones de la ecuación de Michaelis-Menten
4.Factores que modifican la actividad enzimática
a) Efecto del pH sobre la actividad enzimática
La mayoría de las enzimas tienen
un pH característico al cual su actividad es máxima;
por encima o por debajo de ese pH la actividad
disminuye.
En muchos casos los perfiles de
actividad de las enzimas en función del pH son
acampanados. En otros casos no.
La relación del pH con la actividad de la enzima depende del comportamiento
ácido-base de la misma, así como de otros factores difíciles de analizar de
forma cuantitativa.
El pH
óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH
de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la
pendiente ascendente o descendente de la curva. Por eso la relación pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el
control intracelular de su actividad.
b) Efecto de la temperatura
sobre las reacciones enzimáticas
Al igual que sucede con la
mayoría de las reacciones químicas, las reacciones enzimáticas
incrementan su velocidad con la temperatura.
La velocidad de muchas
reacciones enzimáticas se duplica, aproximadamente
por cada 10 1C de aumento de la temperatura.
El pico de la gráfica al
representar la actividad catalítica respecto a la temperatura se debe a que las
enzimas, al ser proteínas, se desnaturalizan por acción del calor y se
inactivan a partir de cierto punto. Luego la aparente temperatura
"óptima" viene determinada por estos dos procesos:
1) El incremento habitual de la
velocidad de la reacción con la temperatura.
2) El incremento en la
desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar una temperatura crítica.
A partir de los 55-60 1C la mayor parte de las enzimas
se inactivan. Sin embargo, las enzimas de bacterias termofílicas
siguen siendo activas a temperaturas superiores a los 85 1C.
La ribonucleasa
-como vimos en el tema de proteínas- recupera rápidamente su conformación y su
actividad por enfriamiento.
c) Inhibición de las enzimas
La inhibición de algunas enzimas
por metabolitos específicos constituye un elemento importante en la regulación
del metabolismo intermediario.
Los tres tipos principales de
inhibición reversible de las enzimas son: competitiva, acompetitiva y no competitiva. Se estudian
experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en la cinética de
reacción de la enzima.
*Inhibición competitiva: el
inhibidor puede combinarse con la enzima libre de tal modo que compite con el
sustrato normal para unirse al centro activo.
Un inhibidor competitivo
reacciona reversiblemente con la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor
(E-I) análogo al complejo enzima sustato:
E+I <=====> EI
La vmáx
de la reacción catalizada por la enzima no variará en
presencia del inhibidor competitivo (lógicamente, cuando la [S] sea muy
elevada, apenas habrá ocasión de que se una la E con una molécula de I).
En cambio la Km
aparente del sustrato aumentará en presencia del inhibidor (es decir, será
precisa una [S] superior para alcanzar 1/2vmáx). Por lo tanto, en la cinética
se refleja como una disminución de la afinidad de E por S.
Un ejemplo clásico de inhibición
competitiva es la de la succinatodeshidrogenasa por el malonato
y por otros aniones dicarboxilato.
*Inhibición acompetitiva:
aquí el inhibidor no se combina con la enzima libre. Sin embargo se combina con
el complejo enzima-sustrato-inhibidor (E-S-I), el cual no se transforma
en el producto habitual de la reacción:
ES+I <===> ESI
La presencia del inhibidor hace
que disminuya la Kmaparente en
la misma proporción que la vmáx (como el I
se une al complejo ES, su presencia se manifiesta también a elevadas [S], por
lo que disminuye vmáx).
La Km
aparente disminuye (lo cual quiere decir que la [S] precisa para alcanzar
1/2vmáx
será menor). No es que haya aumentado la afinidad de E por S: en realidad se
mantiene igual, pero como la vmáx ha
disminuido, se precisará menor [S] para alcanzar 1/2vmáx y
por eso la Km disminuye -y la afinidad
aumenta- "aparentemente".
La inhibición acompetitiva
es poco frecuente en las reacciones de un solo sustrato, pero es corriente en
las reacciones de dos sustratos.
*Inhibición no competitiva: el
inhibidor no competitivo puede combinarse con la enzima libre (E) o con
el complejo enzima sustrato (ES), e interfiere en la acción de ambos:
E+I <===> EI
ES+I <===> ESI
La presencia del inhibidor hace
que decrezca la vmáx (es decir, no puede
ser compensada su presencia por elevadas [S]) pero la Km
aparente no varía (o sea, que a la misma [S] se alcanza la 1/2 vmáxcorrespondiente a la presencia
del inhibidor). En realidad la afinidad de E por S sí ha disminuido realmente
(aunque no "aparentemente").
Algunas enzimas (no todas) que
poseen un grupo -SH esencial, son inhibidas no competitivamente por iones de
metales pesados (la enzima requiere esos grupos -SH intactos para su actividad
normal).
El agente quelante
EDTA (tetra-acetato de etilen-diamida) se une reversiblemente al Mg2+ y a
otros cationes divalentes, e inhibe así de modo no competitivo a algunas
enzimas que precisan esos iones para su actividad.
*Inhibición irreversible: no
puede ser tratada por los principios de Michaelis-Menten.
d) Enzimas reguladoras
Son aquellas que desarrollan su
actividad en reacciones "estratégicas" del metabolismo. Pueden ser de
2 tipos:
1) Enzimas alostéricas: cuya actividad catalítica es modulada por
la unión no-covalente de un metabolito específico a un centro de la proteína
distinto del centro catalítico.
2) Enzimas moduladas covalentemente.
Estudiaremos las primeras:
Las enzimas alostéricas
poseen, además del centro catalítico, otro espacio al que se enlaza de modo
reversible y no covalente el efector o modulador. En general, el centro alostérico es tan específico para la unión del modulador
como el centro catalítico (o centro activo) lo es para la unión del sustrato.
Los moduladores pueden aumentar
la actividad enzimática y llamarse moduladores
activos o estimuladores. También hay moduladores negativos o inhibidores,
que actúan dificultando la actividad enzimática (es
el caso de la inhibición por el producto final, inhibición feed-back o retroinhibición).
e) Cooperatividad
Las enzimas alostéricas
no muestran generalmente la clásica relación cinética de Michaelis-Menten entre [S], vmáx
y Km. Y muchas presentan una gráfica sigmoidea en vez de
hiperbólica cuando se representa la velocidad en función de la [S]. Esto es un
ejemplo de cooperatividad positiva (la
unión de una molécula de sustrato a un centro incrementa la unión de las
moléculas de sustrato a los demás centros).
Conviene aclarar que no todas
las enzimas alostéricas exhiben curvas sigmoidales al representar v0 frente a [S];
además, no todas las enzimas que muestran tales curvas son necesariamente alostéricas.
Otras enzimas presentan cooperatividad negativa: la unión de una
molécula de sustrato provoca un descenso en la unión de moléculas de sustrato
subsiguientes.