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TEMA 4: LAS ENZIMAS

 

CONTENIDO

TEMA 4: LAS ENZIMAS

1. CONCEPTO Y ESTRUCTURA.

2. ESPECIFICIDAD Y MECANISMO DE ACCIÓN. Especificidad de sustrato. Factores que contribuyen a la actividad catalítica

3. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN.

4. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Efecto del pH y de la Temperatura sobre la actividad enzimática. Inhibición de las enzimas: reversible (competitiva acompetitiva y no competitiva) e irreversible. Enzimas reguladoras. Cooperatividad.

 

1. Concepto y estructura

 

Son moléculas de naturaleza proteica especializadas en la catálisis de las reacciones biológicas. Son biocatalizadores.

Para que las reacciones bioquímicas que se dan en los seres vivos se produzcan en el laboratorio se precisan condiciones de alta temperatura u otras condiciones que aporten la energía necesaria para dichas reacciones. Pero esa elevación de la temperatura resultaría muy perjudicial para los seres vivos. Las enzimas salvan ese obstáculo y actúan como catalizadores mucho más eficaces que los catalizadores hechos por el hombre.

Todas las enzimas conocidas son proteínas de gran difusibilidad en los medios líquidos del organismo. La mayoría son solubles en agua.

Atendiendo a la composición se distinguen 2 tipos de enzimas:

*Holoproteínas: cuya molécula está constituida solamente por secuencias de aminoácidos. Poco frecuentes. Ej.: la ribonucleasa y la lisozima.

*Heteroproteínas: cuya molécula está formada por 2 componentes:

 

1) Uno de naturaleza proteica, llamado apoenzima. Los aminoácidos que forman la apoenzima pueden clasificarse en diversos grupos:

.No esenciales: no participan directa ni indirectamente en el proceso catalítico, de forma que pueden ser eliminados de la cadena polipeptídica sin que se pierda la actividad enzimática.

.Estructurales: que mantienen la estructura terciaria de la proteína enzimática. No intervienen directamente en la catálisis, pero sí indirectamente, pues determinan la posición del centro activo de la molécula.

.De unión o fijación: que sujetan la apoenzima al sustrato y orientan la molécula de éste de tal manera que aproximan la parte que ha de ser atacada por la enzima al sitio catalítico de ésta.

.Catalíticos: responsables directos de la actividad enzimática, que forman el sitio catalítico.

Los aminoácidos de fijación y los catalíticos forman el centro activo de la apoenzima, que ocupa una pequeña parte de la molécula de la apoenzima.

 

2) Otro no proteico (grupo prostético), llamado cofactor. El cofactor puede ser un ión metálico, o bien una molécula orgánica de bajo peso molecular llamada coenzima. Actualmente se sabe que las coenzimas desarrollan su actividad enzimática cumpliendo alguna o algunas de las siguientes funciones:

.Colaborar en el acoplamiento del sustrato al centro activo de la apoenzima.

.Servir como sitio adicional de fijación del sustrato.

.Participar directamente en el mecanismo catalítico, actuando de forma análoga a los aminoácidos catalíticos del centro activo de la apoenzima.

El conjunto (apoenzima + cofactor), catalíticamente activo, se denomina holoenzima. La apoenzima separada del cofactor es catalíticamente inactiva.

 


Además de los glúcidos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, las células vivas contienen también unas sustancias orgánicas que actúan en cantidades mínimas y que denominamos vitaminas. La importancia de estas sustancias se manifestó al comprobar que algunos organismos no las pueden sintetizar y deben adquirirlas, por tanto, por vía exógena. Las vitaminas -que, para su estudio, suelen clasificarse en dos grandes grupos: liposolubles e hidrosolubles-, son componentes esenciales de las coenzimas.

En la siguiente tabla aparecen las principales vitaminas, las coenzimas de las que forman parte y las reacciones metabólicas específicas catalizadas por las enzimas correspondientes.

 

 

2. Especificidad y mecanismo de acción

 

Una reacción química A===>B tiene lugar porque cierto número de moléculas A se encuentran con la suficiente energía como para alcanzar un estado activado, que denominamos estado de transición, en el que es muy probable que se establezca o se rompa algún enlace químico y se forme entonces el producto P.

La velocidad de una reacción será proporcional a la concentración de moléculas en ese estado de transición. Por eso hay 2 métodos generales mediante los cuales se puede acelerar la velocidad de una reacción química:

-Elevar la temperatura: pues se incrementa el n1 de moléculas capaces de alcanzar el estado de transición (en muchas reacciones químicas la velocidad se duplica cada 10 1C de aumento de la T).

-Añadir un catalizador: que se combina con los reaccionantes de forma transitoria y produce un estado de transición con menor energía de activación. (Nota: la energía libre de activación es la diferencia entre la energía libre -G- de 1 mol de sustancia en el estado de transición y la de 1 mol de sustancia en el estado inicial).

 

Energía libre de activación (ΔGº) calculada para

La descomposición de peróxido de hidrógeno a 20 ºC. La catalasa acelera la v de la reacción más de 108 veces.

Condiciones log ΔGº(Kcal/mol)

Sin catalizar 18

Catalizada con Pt coloidal 13

Catalizada por catalasa 7

 


Las enzimas aceleran la v de las reacciones por el segundo sistema. Actúan como catalizadores al disminuir la energía de activación de las sustancias reaccionantes.

En toda reacción enzimática intervienen dos elementos: por una parte, la enzima; por otra, el sustrato (sustancia o sustancias que, mediante una reacción catalizada por la enzima, se transformará en otro producto o productos).

Cuando se forman los productos de la reacción se regenera el catalizador libre.

 

a) Especificidad de sustrato de las enzimas

 

Una de las propiedades más notables de las enzimas es su especificidad de acción, por la que actúan sólo sobre determinados sustratos y producen sólo un tipo de reacción (sin reacciones colaterales).

Si en una reacción de laboratorio el rendimiento fuese de un 90%, podríamos darnos por satisfechos. Pero si esa reacción fuese el paso de una secuencia de 10 etapas, cada una de las cuales tuviese un rendimiento del 90%, en el producto final sólo recuperaríamos 1/3 del producto inicial. De no ser por la especificidad de las enzimas, las células quedarían rápidamente inmersas en un conjunto de reacciones laterales y productos secundarios.

Emil Fisher descubrió que las enzimas que hidrolizaban glucósidos eran capaces de distinguir entre formas estereoisómeras de éstos. En 1894 enunció el principio de que la molécula del sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo harían una llave y una cerradura, es decir, que tienen una relación complementaria. El centro activo es el lugar de la enzima que se adapta exactamente a la estructura molecular del sustrato y actúa sobre éste para dar lugar al producto. La estructura del centro activo explica la especificidad de acción de las enzimas.


No obstante, los datos actuales sobre la estructura de las enzimas han llevado a modificar el modelo clásico de la llave y su cerradura para explicar la especificidad de la reacción enzimática. Actualmente se considera que esa esfecificidad radica en la naturaleza de los aminoácidos de fijación del centro activo. Realizada esa fijación o anclaje, la enzima puede modificar su forma y amoldarse parcialmente sobre el sustrato, de forma que el centro catalítico quede correctamente situado para actuar. Entonces no existiría como en la llave y la cerradura una adaptación predeterminada, sino una adaptación inducida por los aminoácidos de fijación.

Además el grado de especificidad puede ser muy variado.

Así, la aspartato-amoniaco-liasa, también conocida por aspartasa, tiene una especificidad de sustrato casi absoluta. Además presenta una estereoespecificidad estricta (es incapaz de desaminar el D-aspartato).

Otra enzima estereoespecífica es la lactato deshidrogenasa (sólo trabaja con L-lactato).

En cambio, la fosfatasa alcalina hidroliza muchos ésteres diferentes del ácido fosfórico. Y la carboxipeptidasa cataliza la hidrólisis del enlace peptídico C-terminal, cualquiera que sea la longitud de la cadena o el resto aminoácido C-terminal.

En general, la especificidad del sustrato sobre el que actúan las enzimas se debe a dos rasgos estructurales del sustrato:

1) Un enlace químico susceptible de ser atacado por la enzima.

2) Otra característica estructural necesaria para efectuar su unión al centro activo de la enzima. Dicha estructura se denomina grupo determinante de la posición.

 

b) Factores que contribuyen a la actividad catalítica de las enzimas

 

Hemos dicho que las enzimas incrementan de forma considerable la velocidad de las reacciones que catalizan. Son 4 los factores que parecen contribuir al gran incremento de velocidad producido por las enzimas:

 

*Proximidad y orientación del sustrato. La enzima puede fijar la molécula de sustrato de modo que el enlace susceptible se halle:

-próximo al grupo catalítico

-bien orientado respecto al grupo catalítico.

Esa proximidad y orientación adecuadas del sustrato respecto al grupo catalítico permiten que se alcance con facilidad el estado de transición y se incremente de forma considerable (en el caso más espectacular hasta 53.000 veces) la velocidad de reacción.

*Catálisis covalente. Algunas enzimas se combinan con el sustrato para formar un intermediario covalente que reacciona con más facilidad para formar los productos.

Este compuesto se forma y se destruye rápidamente.

 

*Catálisis ácido-base. Al proporcionar grupos funcionales capaces de actuar como dadores o aceptores de protones, la enzima puede efectuar una catálisis general ácida o básica.

La catálisis ácido-base específica es la debida al incremento o disminución del pH.

En la catálisis ácido-base general el catalizador actúa como aceptor o dador de protones.

La catálisis ácido-base general proporciona un medio para efectuar la catálisis a pH neutro (en el que las concentraciones de H+ y de OH- son muy bajas) de reacciones químicas que de otro modo necesitarían concentraciones muy elevadas de esos iones.

 

*Factor de tensión de la catálisis enzimática. La enzima puede inducir una tensión o una distorsión en el enlace susceptible de la molécula de sustrato, que determine que la ruptura del enlace sea más fácil.

 

 

3. Cinética de las reacciones catalizadas por enzimas. Ecuación de Michaelis-Menten

 

En las reacciones enzimáticas se da un efecto ausente en las no enzimáticas: la saturación con el sustrato.

A partir de la saturación la reacción es esencialmente de orden cero respecto al sustrato (es decir, se mantiene con un v constante).

-d[A]

reacc. química de 1er. orden: A ===> P ------- = K[A]

dt

 

-d[A]

reacc. química de 21 orden: A + B ===> P ------- = K[A][B]

dt

 

reacc. química de 3er. orden: son raras.

 

Teoría de Michaelis y Menten:

Luego: La constante de Michaelis-Menten KM es igual a la concentración de sustrato en la que la velocidad inicial de la reacción es la mitad de la velocidad máxima.

Conviene recordar que la KM no es un valor fijo para cada enzima, sino que puede variar con:

-la estructura del sustrato

-el pH

-la temperatura

*Transformaciones de la ecuación de Michaelis-Menten

4.Factores que modifican la actividad enzimática

 

a) Efecto del pH sobre la actividad enzimática

 

La mayoría de las enzimas tienen un pH característico al cual su actividad es máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye.

En muchos casos los perfiles de actividad de las enzimas en función del pH son acampanados. En otros casos no.

La relación del pH con la actividad de la enzima depende del comportamiento ácido-base de la misma, así como de otros factores difíciles de analizar de forma cuantitativa.

El pH óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de la curva. Por eso la relación pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.

 

b) Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimáticas

 

Al igual que sucede con la mayoría de las reacciones químicas, las reacciones enzimáticas incrementan su velocidad con la temperatura.

La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica, aproximadamente por cada 10 1C de aumento de la temperatura.

El pico de la gráfica al representar la actividad catalítica respecto a la temperatura se debe a que las enzimas, al ser proteínas, se desnaturalizan por acción del calor y se inactivan a partir de cierto punto. Luego la aparente temperatura "óptima" viene determinada por estos dos procesos:

1) El incremento habitual de la velocidad de la reacción con la temperatura.

2) El incremento en la desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar una temperatura crítica.

A partir de los 55-60 1C la mayor parte de las enzimas se inactivan. Sin embargo, las enzimas de bacterias termofílicas siguen siendo activas a temperaturas superiores a los 85 1C.

La ribonucleasa -como vimos en el tema de proteínas- recupera rápidamente su conformación y su actividad por enfriamiento.

 

c) Inhibición de las enzimas

 

La inhibición de algunas enzimas por metabolitos específicos constituye un elemento importante en la regulación del metabolismo intermediario.

Los tres tipos principales de inhibición reversible de las enzimas son: competitiva, acompetitiva y no competitiva. Se estudian experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en la cinética de reacción de la enzima.

 

*Inhibición competitiva: el inhibidor puede combinarse con la enzima libre de tal modo que compite con el sustrato normal para unirse al centro activo.

Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor (E-I) análogo al complejo enzima sustato:

E + I <=====> EI

La vmáx de la reacción catalizada por la enzima no variará en presencia del inhibidor competitivo (lógicamente, cuando la [S] sea muy elevada, apenas habrá ocasión de que se una la E con una molécula de I).

En cambio la Km aparente del sustrato aumentará en presencia del inhibidor (es decir, será precisa una [S] superior para alcanzar 1/2 vmáx). Por lo tanto, en la cinética se refleja como una disminución de la afinidad de E por S.

Un ejemplo clásico de inhibición competitiva es la de la succinato deshidrogenasa por el malonato y por otros aniones dicarboxilato.

 

*Inhibición acompetitiva: aquí el inhibidor no se combina con la enzima libre. Sin embargo se combina con el complejo enzima-sustrato-inhibidor (E-S-I), el cual no se transforma en el producto habitual de la reacción:

ES + I <===> ESI

La presencia del inhibidor hace que disminuya la Km aparente en la misma proporción que la vmáx (como el I se une al complejo ES, su presencia se manifiesta también a elevadas [S], por lo que disminuye vmáx).

La Km aparente disminuye (lo cual quiere decir que la [S] precisa para alcanzar 1/2 vmáx será menor). No es que haya aumentado la afinidad de E por S: en realidad se mantiene igual, pero como la vmáx ha disminuido, se precisará menor [S] para alcanzar 1/2 vmáx y por eso la Km disminuye -y la afinidad aumenta- "aparentemente".

La inhibición acompetitiva es poco frecuente en las reacciones de un solo sustrato, pero es corriente en las reacciones de dos sustratos.

 

*Inhibición no competitiva: el inhibidor no competitivo puede combinarse con la enzima libre (E) o con el complejo enzima sustrato (ES), e interfiere en la acción de ambos:

E + I <===> EI

ES + I <===> ESI


La presencia del inhibidor hace que decrezca la vmáx (es decir, no puede ser compensada su presencia por elevadas [S]) pero la Km aparente no varía (o sea, que a la misma [S] se alcanza la 1/2 vmáx correspondiente a la presencia del inhibidor). En realidad la afinidad de E por S sí ha disminuido realmente (aunque no "aparentemente").

Algunas enzimas (no todas) que poseen un grupo -SH esencial, son inhibidas no competitivamente por iones de metales pesados (la enzima requiere esos grupos -SH intactos para su actividad normal).

El agente quelante EDTA (tetra-acetato de etilen-diamida) se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de modo no competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para su actividad.

 

*Inhibición irreversible: no puede ser tratada por los principios de Michaelis-Menten.

 

d) Enzimas reguladoras

 

Son aquellas que desarrollan su actividad en reacciones "estratégicas" del metabolismo. Pueden ser de 2 tipos:

1) Enzimas alostéricas: cuya actividad catalítica es modulada por la unión no-covalente de un metabolito específico a un centro de la proteína distinto del centro catalítico.

2) Enzimas moduladas covalentemente.

Estudiaremos las primeras:

Las enzimas alostéricas poseen, además del centro catalítico, otro espacio al que se enlaza de modo reversible y no covalente el efector o modulador. En general, el centro alostérico es tan específico para la unión del modulador como el centro catalítico (o centro activo) lo es para la unión del sustrato.

Los moduladores pueden aumentar la actividad enzimática y llamarse moduladores activos o estimuladores. También hay moduladores negativos o inhibidores, que actúan dificultando la actividad enzimática (es el caso de la inhibición por el producto final, inhibición feed-back o retroinhibición).

 


e) Cooperatividad

 

Las enzimas alostéricas no muestran generalmente la clásica relación cinética de Michaelis-Menten entre [S], vmáx y Km. Y muchas presentan una gráfica sigmoidea en vez de hiperbólica cuando se representa la velocidad en función de la [S]. Esto es un ejemplo de cooperatividad positiva (la unión de una molécula de sustrato a un centro incrementa la unión de las moléculas de sustrato a los demás centros).

Conviene aclarar que no todas las enzimas alostéricas exhiben curvas sigmoidales al representar v0 frente a [S]; además, no todas las enzimas que muestran tales curvas son necesariamente alostéricas.

Otras enzimas presentan cooperatividad negativa: la unión de una molécula de sustrato provoca un descenso en la unión de moléculas de sustrato subsiguientes.